В начале 1500 года Леонардо покинул Милан и возвратился во Флоренцию. Здесь он продолжает свои научные занятия, живописью же занимается мало.
Не имея крупных заказов во Флоренции, Леонардо был принужден поступить на службу к Цезарю Борджа. Но полная тревог жизнь у хищного и коварного Цезаря Борджа, использовавшего Леонардо лишь как военного инженера, не удовлетворяла мастера. Поэтому 5 марта 1503 года он возвращается во Флоренцию, где его услуги понадобились гонфалоньеру Содерини в борьбе республики с Пизой. И в этот свой флорентийский приезд Леонардо сочетает занятия живописью с серьезными научными работами.
Первой крупной художественной работой Леонардо во Флоренции была роспись в зале Большого Совета в Палаццо Веккио. В качестве сюжета Леонардо избрал битву при Ангиари, закончившуюся победой флорентийцев над ломбардскими войсками. Между 1503 и 1505 годами мастер исполнил картон, а в 1505 году приступил к самой росписи, которую оставил незаконченной к моменту своего вторичного отъезда (30 мая 1506 года) в Милан. Ни картон, ни роспись Леонардо не дошли до нас, но сохранилась серия великолепных подготовительных к ним набросков и этюдов самого мастера.
Это произведение Леонардо стоит у истоков батального жанра в искусстве нового времени. В полной драматизма и динамики композиции, эпизоде битвы за знамя, дан момент высшего напряжения сил сражающихся, раскрыта жестокая правда войны.
Около 1503 года Леонардо выполнил портрет Моны Лизы, супруги богатого флорентийца Франческо Джокондо.
«Мне удалось создать картину действительно божественную» – так оценил портрет сам Леонардо.
По словам Вазари, художник приглашал, во время позирования Моны Лизы, людей, игравших на лире и певших, и постоянно держал шутов, призванных развлекать ее, чтобы этим способом устранить меланхоличность, свойственную обыкновенно живописным портретам. С помощью таких мер Леонардо стремился вызвать на лице своей модели ту улыбку, которую он и запечатлел в своем произведении. Подобно пропорциям леонардовских фигур, эта улыбка построена на глубоком знании строения человеческого лица и на строгом учете индивидуальной выразительности его отдельных частей.
«Сложный полуфантастический пейзаж тонко гармонирует с характером и интеллектом портретируемой. Кажется, что зыбкая изменчивость самой жизни ощущается в выражении ее лица, оживленного едва уловимой улыбкой, в ее спокойно уверенном, проницательном взгляде. Лицо и холеные руки патрицианки написаны с удивительной бережностью, мягкостью. Тончайшая, словно тающая, дымка светотени (так называемое сфумато), окутывая фигуру, смягчает контуры и тени; в картине нет ни одного резкого мазка или угловатого контура» (М.Т. Кузьмина).